Vuosittain järjestettävän EURL-Salmonella workshopin esitykset tulevat EU:n vertailulaboratorion nettisivuille. Osallistujia kokouksessa oli yhteensä 75.
Kirsten Mooijman kävi läpi esityksessään ISO / CEN toimintaan liittyviä ajankohtaisia asioita:
- 2020 on julkaistu ISO 6579-1:2017 / Amd. 1:2020 laajennusosa ISO 6579-1:2017 liittyen. Standardissa ISO 6579-1:2017 oli havaittu virhe kohdassa D 3.1.3.1 eli L-kysteiini liuoksen määrän tulee olla 10 ml eikä 100 ml ja ohjeen MSRV agar antaa MgCl2 pitoisuudeksi 14,9 g/l, jos tehdään itse yksittäisistä aineksista, vaikka pitäisi olla 10,9 g/l (useimmissa kaupallisissa valmisteissa on oikea määrä). Lisäksi myös kaikille selektiivisille elatusaineille, joiden lämpötila on ollut 37±1 °C, voidaan käyttää laajempaa lämpötila-aluetta 34-38 °C. Annex D (S. Typhi ja Paratyphi) oli muutettu informatiiviseksi eli kohdan mukaisesti toimitaan vain, jos erityisesti epäillään näitä serotyyppejä, ei aina.
- ISOn ja CENin standardiehdotus.monofaasisen S. Typhimurium – kantojen tunnistamiseksi oli hyväksytty äänestyksessä ja menetelmien testaus jatkuu.
- ISO 16140-3: “Protocol for verification of reference and validated alternative methods implemented in single laboratory” seuraava äänestys syksyllä 2020
- ISO 16140-4 “Protocol for single-laboratory (in-house) method validation” ja ISO 16140-5 “Protocol for factorial interlaboratory validation of non-proprietary methods” julkaistu heinäkuussa
- EN ISO 16140-6 “Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and typing procedures” julkaistu joulukuussa 2019
- EN ISO 23418 “Microbiology of the Food Chain — Whole genome sequencing for typing and genomic characterization of foodborne bacteria — General requirements and guidance” äänestys tulossa syksyllä 2020
Wilma Jacobs piti seikkaperäisen esityksen liittyen käytännön asioihin, kun verifioidaan menetelmiä EN ISO 16140-3 mukaisesti.
Syksyn 2019 vertailututkimukseen salmonellan osoittamisesta siipikarjan ulostenäytteistä osallistui yhteensä 35 laboratoriota ja kaikki menestyivät hyvin. Tutkimuksessa jäi kaiken kaikkiaan löytymättä vain kolme alemman tason positiivista ja yksi korkeamman tason positiivinen. ISO 6579-1: 2017 – menetelmän lisäksi 7 laboratoriota käytti validoitua toista menetelmää (6 PCR -menetelmää ja yksi laajennettu 6579). 5 laboratoriota sai vastaavat tulokset kuin ISO 6579-1: 2017 – menetelmällä, mutta menetelmiä ei esityksessä kuvattu.
Salmonellan osoittaminen simpukoista vertailututkimus oli ensimmäinen EURL-Salmonellan järjestämä vertailututkimus EURL Bivalves Mollucsin tehtävien jakauduttua eri EURL laboratorioille UK:n tehtävien siirryttyä muille 2019 alusta. Tutkimukseen osallistui 23 laboratoriota, joista loppukesästä 9, kun COVID-19 vuoksi kaikki eivät pystyneet osallistumaan ensimmäiseen kierrokseen. 21 laboratoriota menestyi hyvin, 1 tyydyttävästi ja 1 joutui uusintatutkimukseen todettuaan negatiivisen näytteen positiiviseksi. ISO – menetelmän lisäksi viisi laboratoriota käytti qPCR-, yksi Rapid Salmonella- ja yksi Bax system – menetelmää ja saivat vastaavat tulokset kuin ISO -menetelmällä.
Syksyn 2019 serotyypitysvertailututkimukseen osallistui 35 laboratoriota, joista 33 menestyi hyvin. Kaksi EU – maiden ulkopuolista laboratoriota sai lisäkoulutusta. Tutkimukseen valitaan vuosittain 20 kantaa, joiden joukossa ovat ainakin viisi tärkeintä serotyyppiä EU:n alueella sekä kantoja, jotka voidaan sotkea edellisiin tai muuten aiheuttavat vaikeuksia tyypityksessä. Tutkimuksissa O-antigeenit olivat 99 % oikein, H-antigeenit 97 % ja serovarien nimet 97 % oikein.
Syksyllä 2019 toteutettiin myös vapaaehtoinen klusterianalyysitutkimus PFGE ja / tai MLVA ja / tai WGS:llä, johon osallistui 18 laboratoriota. WGS:llä osallistui 14 laboratoriota. Menestymiskriteereitä ei oltu asetettu, koska klusterin määrittäminen vaihtelee mm. tutkimuksen tarkoituksen mukaan. WGS:llä EURL-salmonella itse piti tässä tutkimuksessa rajana 7 eroa. Mm. laatukriteereissä ja nimeämisissä eroja. Vaatii vielä paljon standardointia ja yhtenäistämistä ja näillä piloteilla saadaan siihen tietoa. Syksyllä 2020 järjestetään uusi tutkimus.
Jokaim Skarin kertoi WGS datan klusterianalyysistä. EURL laboratorioiden välinen NGS -työryhmä (next generation sequencing) on laittamassa loppuvuodesta EURL laboratorioiden nettisivuille 8 eri alaryhmän tuottamat dokumentit liittyen NGS:ään. Eistyksessään Skarin kävi läpi mm. sitä miksi ja miten WGS – klusterointia tehdään ja milloin kannattaa käyttää SNP (single nucleotide polymorphism) ja milloin geeni geeniltä (esim. MLST, cgMLST, wgMLST) lähestymiskulmaa.
Sarah Denayer kuvasi epidemiologista selvitystä liittyen belgialaisessa hotellikoulussa todettuun S. Enteritidis (MLVA 3-12-5-5-1, ST11) epidemiaan. Epidemia aiheutui kontaminoituneista espanjalaisista kananmunista, joita oli käytetty tartar kastikkeen tekoon. Epidemia varmistettiin käyttämällä WGS:ää sekä ihmisistä, ruoanjätteistä ja munista eristetyille kannoille.
Angela van Hoekin esityksessä WGS tyypitystä oli multi-resistenttien, Alankomaissa broilereista ja ihmisistä eristettyjen S. Infantis – kantojen vertailuun. Aiemmin S. Paratyphi B var. Java oli yleisin serotyyppi siipikarjalla Alankomaissa, mutta vuonna 2018 S. Infantis oli eniten raportoitu serotyyppi broilereissa ja siipikarjanlihassa sekä Alankomaissa että Euroopassa. Se on ollut myös neljänneksi yleisin serotyyppi ihmisissä molemmissa useana vuonna. 2014 tunnistettiin multi-resistentti S. Infantis, jolla oli megaplasmidi pESI (noin 300 Kb). Tutkimuksessa käytiin 198 broileritilalla ja 379 parvea tutkittiin sekä 81 tilalta näytteet myös ihmisistä (132 henkilöä). 11,9 % tiloista oli positiivisia ja S. Infantis todettiin 5,1 % tiloista. Tilojen ihmisistä todettiin yksi salmonella, S. Infantis. Kaikkiaan WGS tutkimukseen valittiin 32 S. Infantis kantaa (13 ihmisistä) ja ne olivat tyyppiä ST32. cgMLST tutkimuksella kantojen välillä oli kuitenkin eroja ja jopa saman tilan eri parvista eristetyt kannat poikkesivat toisistaan, vaikka klusteroituivatkin. 156 VFs (virulenssifaktoria) tutkittiin ja 83,3 % tekijöistä olivat identtisiä. pESI plasmidin prevalenssi oli 87,5 % (28/32). Kannoilla oli korkea prevalenssi viidelle eri antibioottiresistenssigeenille ja viisi ihmiskantaa oli ESBL – tuottajia.
Robin Diddens kävi läpi ISO 6579-4 (Identification of monophasic Salmonella Typhimurium) standardin kehitystyötä. Ko. serotyyppi on lisääntynyt paljon Euroopassa ja muualla maailmassa ja sen varmistamiseksi julkistettiin PCR – menetelmä 2010. 2014 on alkanut standardointityö ISOssa ja menetelmään kuuluu kolme eri protokollaa: multiplex real-time PCR, geelipohjainen multiplex PCR ja geelipohjainen single target PCR. Protokollia on testattu Alankomaiden EURL:ssä ja Saksan NRL:ssä rinnan ja hiottu testausten perusteella. Tarkoitus on siis osoittaa ero monofaasisen ja tavallisen S. Typhimuriumin sekä 6 muun serotyypin, joihon voidaan sotkea pelkän monofaasisen tuloksen perusteella, välillä sen varmistamiseksi, että kyseessä on todella monofaasinen S. Typhimurium. Asialla on sikäli merkitystä, että useissa Euroopan maassa vastustetaan vain tiettyjä serotyyppejä (joihin monofaasinen STM kuuluu), kun esim. Suomessa vastustetaan kaikkia serotyyppejä. Elokuussa 2020 päättyneessä ISOn ja CENin äänestyksessä ehdotus hyväksyttiin 100% pienillä kommenteilla ja standardin kehitystyö jatkuu.
Katherine Newton kertoi UK:n itäosassa tehdystä tutkimuksesta, jossa vertailtiin erilaisin menetelmin S. Typhimuriumin ja monofaasisen S. Typhimuriumin esiintymistä ja leviämistä tuotantotiloilla 1990 alkaen. Ensimmäinen monofaasisen STM:n eristys tehtiin sikatilalta. 2010 asti leviäminen tapahtui sikatilojen välillä, mutta 10/2010 ensimmäinen siipikarja infektoitui sikatilalta saadusta tartunnasta. 2019 mennessä leviämiset ovat tapahtuneet pääasiassa sikatiloilta siipikarjatiloille eikä toisin leviämistä ole juuri esiintynyt.
Mirko Rossi EFSAsta esitteli ”One Healt” systeemin kehitystyötä WGS tiedon keräämiseksi elintarvike/eläin eristyksistä, mutta esitystä ei laitettu nettisvuille asian ollessa vielä sen verran kesken.
Vuoden 2021 workshop pidetään todennäköisesti Alankomaissa, jos tilanne sallii matkustamisen.
Lisätietoja: erikoistutkija Henry Kuronen, henry.kuronen@ruokavirasto.fi