16th Annual Workshop of the NRLs for Listeria monocytogenes – 17 to 18 May 2022 – Porto, Portugal

Kokous toteutettiin hybriditilaisuutena. Yhteensä kokouksessa oli 78 osallistujaa, joista 33 oli paikan päällä Portossa ja 45 osallistui Teamsin välityksellä.

Epidemology

2020 reporting on Listeriosis in humans and L. monocytogenes in animals and food in the European Union (Saara Kotila, ECDC and Valentina Rizzi, EFSA)

Saara Kotila (ECDC) kertoi listerioositapausten esiintyvyydestä ihmisillä. Vuonna 2020 EU:ssa raportoitiin yhteensä 1 876 listerioositapausta. Vuoteen 2019 verrattuna tapaukset olivat laskeneet 7,1 %. Laskuun oli koronapandemian lisäksi vaikuttanut Iso-Britannian tietojen puuttuminen Brexitin takia. Listeria oli vuonna 2020 Euroopassa viidenneksi yleisin zoonoosi. Listerian edellä olivat Kampylobakteeri, Salmonella, Yersinia ja STEC.

Valentina Rizzi (EFSA) kertoi Listerian esiintymisestä eläimillä ja elintarvikkeissa. Vuoden 2020 esiintyvyyksissä näkyi ihmisten listerioositapausten tavoin koronapandemia ja Brexit. Vuonna 2020 elintarvikevälitteisiä epidemioita oli yhteensä 16, joista 9 näyttö oli vahvaa. Vahvan näytön epidemioista suurin osa (6/9, 67 %) liittyi kalatuotteisiin. Kaksi epidemiaa liittyi lihatuotteisiin ja yhdessä aiheuttajana oli juusto. Keskusteluissa myös muistutettiin, että Listerian osalta epidemiat ovat yleensä pitkiä ja sen takia vaikeasti tutkittavissa. Suurin osa tapauksista on yksittäisiä.

Vuonna 2020 Listeriaa tutkittiin yhteensä 23 567 eläimestä otetusta näytteestä. Näistä positiivisia oli 1,3 %. Suurin osa todetuista Listerioista oli L. monocytogenes, mutta myös muita Listeria-lajeja todettiin. Eläinlajeista Listerian osalta tutkittiin eniten nautoja (N=17 741), joissa esiintyminen oli alhaista (1,0 %).

EFSA One Health System (Mirko Rossi, EFSA)

EFSAn tyypitysjärjestelmän tarkoituksena on kerätä eläimistä, elintarvikkeista, rehuista ja ympäristönäytteistä eristettyjen patogeenien alleeliprofiileja ja niihin liittyviä epidemiologisia tietoja. ECDCllä on mahdollisuus etsiä tiedostoista humaanikantoja vastaavia alleeliprofiileja. Järjestelmän käyttäjä saa ilmoituksen, jos ECDC löytää vastaavuuden omasta tietokannasta. Tavoitteena on helpottaa useita maita koskevien epidemioiden reaaliaikaista selvittämistä.

Jokaisella maalla on koordinaattori (country officer user), joka näkee kaikkien oman maan organisaatioiden datan. Epidemiatilanteessa EFSA on yhteydessä koordinaattoriin. Jokaisella maalla on lisäksi valinnainen määrä datan tuottajia (data provider users), joihin koordinaattori on yhteydessä. EURL rooli on tukea datan tuottajia ja heillä on oikeus nähdä ja analysoida bakteerikohtaisia tietoja kaikista jäsenmaista.

Update on ECDC Listeriosis WGS-enhanced surveillance and current status with listeriosis clusters (Saara Kotila, ECDC)

Saara Kotila (ECDC) esitteli ECDC julkaisemaa strategiaa molekyyli- ja genotyypitysmenetelmien integroimiseksi osaksi eurooppalaista valvontaa ja monia maita koskevien epidemioiden selvittämistä. Tavoitteena reaaliaikainen informaation jakaminen ja analysoiminen nopeaa riskinarviointia varten (RRA, Rapid risk assesment), jatkuva valvonta epidemioiden varhaiseksi havaitsemiseksi ja trendien seuraamiseksi.

Listerian tapauksessa raportoidaan reaaliaikaisesti humaanisekvenssejä ECDCeen, jossa pyritään viikoittain analysoimaan mahdollisia merkkejä epidemioista.

Microbiological shelf-life studies

 Revision of the EURL Lm guidance Document to evaluate the competence of laboratories implementing shelf-life studies (Ludivine Bonanno, EURL Lm)

 EURL Lm ohjetta säilyvyystutkimuksia tekevien laboratorioiden pätevyyden arvioimiseksi ollaan päivittämässä. Tarkoituksena on päivittää ohje vastaamaan ISO 20976-1 standardia, määrittää kriteerit laboratorioiden pätevyyden arvioimiseksi ja laatia luettelo säilyvyystutkimuksia tekevistä laboratorioista.

Revision of the DG SANCO Guidance Document on Listeria monocytogenes shelf-life studies for RTE foods (Helene Bergis, EURL Lm)

Tämänhetkinen ohje säilyvyystutkimusten tekemisestä on vuodelta 2008 ja yhä luonnosvaiheessa. Tarkoituksena on tehdä ohjeesta virallinen ja päivittää se vastaamaan muita säilyvyystutkimuksiin liittyviä dokumentteja. Ohjeen on tarkoitus helpottaa elintarvikealan toimijoiden tulkintaa ja antaa käytännön esimerkkejä.

Expansion of the Listeria monocytogenes set of strains for challenge test studies (Helenen Bergis, EURL Lm)

Vuonna 2012 EURL Lm on luonut joukon kantoja säilyvyystestauksia varten. Kannat on eristetty kolmesta elintarvikematriisista (liha, kala ja maitotuotteista) ja tuotantoympäristöstä. Joukko koostuu kannoista, joilla eri kasvuominaisuuksia eri olosuhteissa (lämpötila, pH ja aw).

Viime aikoina on kuitenkin ollut useita kasviksiin liittyviä epidemioita, minkä takia koettiin tarpeelliseksi lisätä kasviksista eristettyjä kantoja säilyvyystutkimuksissa käytettävien kantojen joukkoon. Tutkimuksissa verrattiin yhteensä 20 eri kasviksista eristettyä Lm-kantaa. Kantojen kasvua tutkittiin erilaisissa haastavissa olosuhteissa (alhainen lämpötila, alhainen pH ja alhainen aw). Tutkimusten perusteella valittiin viisi nopeimmin kasvanutta kantaa, jotka lisättiin säilyvyystutkimuksissa käytettävien kantojen joukkoon.

Lm detection and enumeration

PT on LM detection/enumeration (Lena Barre, EURL Lm)

Edellisen kerran PT-kierros on järjestetty vuonna 2020, jolloin vuorossa oli määritys. Aikaisemmin määritys ja osoitus ovat vaihdelleet vuosittain. Vuonna 2021 ei kuitenkaan järjestetty kierrosta, vaan jatkossa on tarkoitus järjestää kierrokset vain joka toinen vuosi, jolloin tehdään sekä osoitus että määritys. Vuoden 2022 kierros on siis ensimmäinen, missä tehdään sekä määritys että osoitus samasta näytteestä. Kierroksen järjestämisessä on kuitenkin ollut ongelmia resurssitilanteen vuoksi. Kierros yritetään järjestää lokakuussa, mutta se saattaa myös siirtyä vuoden 2023 puolelle.

Alternative methods for L. monocytogenes detection (Nathalie Gnanou-Besse, Mélanie Mancier and Lucas Chikhi, EURL Lm)

Mélanie Mancier ja Lucas Chikhi tekevät lopputyötään Listerian osoittamiseen ja tunnistamiseen käytettäviin vaihtoehtoisiin menetelmiin liittyen. Kyselyn perusteella alle puolet vastanneista laboratorioista (41 %) käyttivät standardimenetelmää ja suurimmalla osalla oli käytössä jokin vaihtoehtoinen menetelmä osoittamiseen ja/tai tunnistamiseen. Listerian osoittamiseen ja tunnistamiseen on tällä hetkellä saatavilla paljon erilaisia vaihtoehtoisia menetelmiä ja heidän lopputyönsä tarkoituksen onkin verrata eri menetelmiä eri ominaisuuksien perusteella (esimerkiksi nopeus ja hinta).

Measurement uncertainty for quantitative analyses (Bertrand Lombard and Lena Barre, EURL Lm)

Ohje mittausepävarmuuden laskemiseen on vuodelta 2019 ja se on tarkoitus päivittää. Ohje on kolmen EURL:n yhteinen (Listeria, Kampylobakteeri ja koagulaasi-positiiviset Stafylokokit). Mittausepävarmuus koostuu teknisestä mittausepävarmuudesta, matriisin mittausepävarmuudesta ja mikrobien epätasaiseen jakautumiseen liittyvästä epävarmuudesta. Tässä esityksessä keskityttiin erityisesti matriisiin liittyvään epävarmuuteen. Matriisiin liittyvä epävarmuus on nimensä mukaisesti matriisikohtainen, jolloin toisen laboratorion matriisiepävarmuutta voidaan hyödyntää myös toisessa laboratoriossa. Referenssilaboratoriolle lähetettiin tähän liittyen kyselyä heille tulevista luonnollisesti kontaminoiduista näytematriiseista. Tarkoituksena oli luoda kaikkien käyttöön lista matriisikohtaisista epävarmuuksista. Kyselyn avulla laadittiin taulukko, josta löytyy tällä hetkellä 31 matriisia 20 eri ruokatyypistä ja 11 eri kategoriasta. Taulukko on saatavilla EURL nettisivuilta.

Improvement of pre-enrichment in EN ISO 11290-1 (Nathalia Gnanou-Besse and Lena Barre, EURL Lm)

Nathalie Gnanou-Besse ja Lena Barre (EURL Lm) esittelivät työryhmän WG32 toimintaa. Työryhmän tavoitteena on parantaa standardin ISO 11290-1 esirikastusvaihetta ja näin ollen sekä L. monocytogenes että Listeria spp. toteamista. Vaihtoehtoina joko parantaa tällä hetkellä käytössä olevaa ½ Fraser-esirikastuslientä tai valita kokonaan uusi esirikastusliemi. Työryhmä on kokoontunut tähän mennessä kerran ja kokouksessa päätettiin uuden alatyöryhmän perustamisesta. Alatyöryhmän tavoitteena on luonnostella menetelmiä ja kriteereitä esirikastusliemien vertailuun.

Method verification using EN ISO 16140-3 (Wilma Jacobs, NL NLR Lm)

Wilma Jacobs esitteli Hollannissa tehtyä menetelmän verifiointia. Verifiointi tehtiin standardin ISO 16140 osan 3 mukaan. Standardisarjassa on kuusi osaa, joista osa 3 tarkoitettu vaihtoehtoisten menetelmien verifiointiin yhdessä laboratorioissa.

Lm characterisation/epidemiosurveillance

Proficiency test on Listeria monocytogenes typing based on WGS and molecular serotyping by PCR (Ludivine Bonanno and Maroua Sayeb, EURL Lm)

Ludivine Bonanno ja Maroua Sayeb esittelivät vuoden 2021 PT-kierroksen tuloksia. Kierroksella lähetettiin 9 kantaa, jotka itse sekvensoitiin ja analysoitiin. Lisäksi lähetettiin 6 kannan sekvenssit pelkästään analysoitavaksi. Kierroksessa oli mukana serotyypitys PCR:llä, cgMLST, wcMLST ja SNP. Kaikkiin osa-alueisiin ei ollut pakollista osallistua.

Serotyypityksen PCR:llä teki 16 laboratoriota, joista hyväksyttävästi suoriutui 75 %. cgMLST-analyysillä osallistui 19 laboratorioita, joista vain 42 % suoriutui hyväksyttävästi. Suurimmalla osalla laboratorioista virhe oli kontaminoituneen kannan tunnistamisessa. wgMLST-analyysillä osallistui 3 laboratoriota, joista yksikään ei suoriutunut hyväksyttävästi. Ongelmana laboratorioilla oli ohjeiden huolellinen lukeminen. SNP-analyysillä osallistui 9 laboratoriota, joista 22 % suoriutui hyväksyttävästi. SNP-analyysissä oli samat ongelmat kuin muissakin analyyseissä, eli kontaminaation tunnistaminen ja ohjeiden huolellinen lukeminen.

Vuoden 2022 kierros järjestetään lokakuussa. Kierroksella lähetetään 4 kantaa ja näiden lisäksi 6 kannan sekvenssit.

Frontline PCR method GenoListeria update (Benjamin Felix, EURL Lm)

Benjamin Felix esitteli GenoListeria PCR-menetelmää. Menetelmällä pystytään tunnistamaan kirjallisuuden perusteella 30 yleisintä klonaalikompleksia. Maat, joissa WGS ei ole vielä käytössä, pystyvät hyödyntämään menetelmää epidemianselvityksessä. Menetelmää onkin jo hyödynnetty Hollannissa epidemianselvityksessä ja Unkarissa maissiin liittyvässä takaisinvedoissa. Tulevaisuudessa menetelmää on tarkoitus kokeilla myös klonaalikompleksien tunnistamiseen suoraan näytteestä.

Starflow: EURL online service for NRLs to characterize Lm and S. aureus strains (Maroua Sayeb and Adrien Assere, EURL Lm)

Starflow on EURL Lm ja CPS yhteistyössä tekemä online-palvelu L. monocytogenes- ja S. aureus -kantojen tyypittämiseen. Palvelussa pystyy kokoamaan sekvenssejä (paired end reads), tyypittämään ja vertaamaan kantaa. Sekvenssit eivät tallennu palveluun. Referenssilaboratorioita kannustettiin kokeilemaan palvelua.

Contamination assessment (Maroua Sayeb, Virgine Chesnais and Déborah Merda, EURL Lm)

Maroua Sayeb, Virgine Chesnais ja Déborah Merda olivat verranneet eri työkaluja kontaminaation havaitsemiseen. Tutkimuksessaan he vertasivat Ridom Seqsphere -ohjelmiston Mash-työkalua avoimen lähdekoodin Kraken2:een ja ConFindriin. Vertailussa heillä oli eri bakteereilla ja eri pitoisuuksilla kontaminoituja näytteitä.

Tulosten perusteella Ridom Seqsphere-ohjelmisto ei havainnut yhtään kontaminaatiota. Lajin sisäisen kontaminaation havaitsi vain Confindr. Lisäksi Confindr havaitsi parhaiten lajien välisen kontaminaation, mutta myös Kraken2 havaitsi sen hyvin. Eri patogeenien välisen kontaminaation Kraken2 havaitsi parhaiten. Confindr havaitsi vain 10 % kontaminaation.